2026年6月16日 呈源生物（RootPath）今天正式发布 VHH CDR Shuffler™ 排列组合式CDR文库。该种文库将三组CDR序列通过排列组合方式拼接为全长组合DNA文库，物理多样性高达200亿独特分子，最快5个工作日交付。

释放VHH候选序列的组合潜力

在VHH（纳米抗体）的发现流程中，研究人员会通过免疫动物筛选、噬菌体/酵母展示筛选、AI计算设计等方式产出一批共享框架区（FWR），但可变区（CDR）各异的候选序列。此外，随着测序技术和AI蛋白设计工具的普及，研究人员有丰富的手段对各CDR区域进行独立优化，获得成百上千条候选序列。将最优的CDR1、CDR2、CDR3排列组合起来进行展示筛选是自然的下一步，但构建这样的组合DNA文库一直是技术瓶颈：100个CDR1 × 100个CDR2 × 100个CDR3会形成100万种组合。虽然现代展示筛选可以轻松处理$10^6$–$10^8$规模的文库，但对于如此庞大的文库，逐条合成既不现实也不经济。研究人员亟需一种准确、高效地获得此类大规模文库的手段。

VHH CDR Shuffler™：一步组装，高效、准确、无序列偏好

VHH CDR Shuffler™ 的核心思路是将每个CDR区域分别合成为均一的寡核苷酸池，然后与四段框架片段（FWR1–FWR4）通过Golden Gate连接一步组装为全长的排列组合文库。

整个流程分为三步：首先，四条FWR片段将分别以质粒形式合成，保证序列准确无误。三个CDR区域分别合成为寡核苷酸池。然后，所有片段通过BsaI位点和配套粘性末端进行一步Golden Gate连接组装。最后，连接产物经5 - 15个循环的PCR扩增，得到最终的双链DNA文库。

我们选择Golden Gate而非Gibson组装或重叠PCR，是因为IIS型限制酶产生的粘性末端定义明确且序列唯一，每个CDR只能插入正确的位置，连接效率高，对序列几乎没有偏好性。这对保证组合文库的均一性至关重要（见下文数据）。

整套流程最快5个工作日完成。首次订购需额外2–3天制备框架片段的质粒，此后使用同一套框架的订单5个工作日即可交付。

NGS表征验证产品质量

为验证组装产物的质量，呈源生物对一个概念验证文库进行了全面的NGS表征。该文库包含1,191个CDR1、1,172个CDR2和1,400个CDR3序列，组合空间接近19.5亿种独特序列。这些序列包括所有的单点突变，以及部分双位点突变。结果如下：

长度保真度高 各CDR区域的长度正确率分别为CDR1：94.2%、CDR2：94.0%、CDR3：80.7%（图2），每碱基缺失率2.0–3.3‰，达到业内最佳寡核苷酸合成水平。三个CDR同时拥有准确长度的概率约72%。

序列保真度高 正确长度reads中精确匹配某一设计序列（在此称为“设计内”）的比例分别为CDR1：93.2%、CDR2：92.3%、CDR3：86.9%（图3）。综合计算，约54%的DNA分子三个CDR全部为设计内序列。这些比例是保守估计，未扣除NGS测序本身的误差。

不同序列丰度分布均一 设计内变异体的丰度分布紧凑（图4），P95/P5比值在2.4×（CDR2）到4.3×（CDR3）之间，即90%的序列丰度差异不超过约3倍。值得注意的是，野生型（WT）序列的丰度相对于期望值偏高1.6×（CDR2）至5.9×（CDR3）。然而，这并非常规建库手段中常见的"野生型模板污染"。本文库的组装完全基于化学合成的寡核苷酸和框架片段，体系中不存在任何野生型模板DNA。尽管存在富集，WT仅占设计内reads的0.14%–0.42%，对文库整体多样性的影响可以忽略不计。其形成机理将在下文嵌合体分析中讨论。

嵌合体是设计外序列的主要来源之一 在正确长度但不匹配设计序列的reads中，一部分是PCR扩增过程中产生的嵌合体（图5）。嵌合体的形成机制是：PCR过程中，一条模板未完全延伸便从模板上脱落，在下一个循环中与另一条不同的模板退火并继续延伸，产生了融合两条亲本序列突变特征的新序列。我们根据亲本突变数量将嵌合体分类：“1+1"嵌合体的突变可拆分为两条不同的单点突变设计序列；“1+2"嵌合体则来自一条单点突变和一条双位点突变设计序列的融合。可识别的嵌合体占正确长度reads的3.7%–7.0%。CDR越长比例越高，符合预期。这些嵌合序列仍在读码框内，相当于文库中额外的功能性多样性。 嵌合体的形成机制也解释了上文提到的野生型富集现象：由于文库中的设计序列大多是在野生型基础上引入少量散在突变，当两条不同突变体的不完全延伸产物互相杂交时，交叉点两侧各自来源于不同亲本，而未发生突变的位点（即野生型碱基）占绝大多数，因此嵌合体更容易重建出野生型序列。

CDR组合完全随机 排列组合文库的核心价值在于让每种CDR1 × CDR2 × CDR3搭配都有均等的被筛选机会。如果组装过程引入了偏好（即某些CDR1序列更容易与特定CDR2共同出现）那么文库实际探索的就不是完整的组合空间，而是一个有偏（bias）的子集。为检验这一点，我们统计了每对CDR的共同出现次数，并与基于独立性假设的泊松分布预测进行比较：如果三个CDR是独立组装的，任意一对的共现频率应完全由各自的边际丰度决定。结果显示，三组配对的R²均达到0.9998以上（图6），实测分布与泊松预测几乎完全重合，证明Golden Gate组装没有引入任何可检测的CDR配对偏好——三个位点是完全独立组装的。在262万条三CDR全部匹配设计的reads中，99.5%为独特的三联体组合，与从真正随机组合池中稀疏采样的预期完全一致。

配套服务与套餐优惠

除文库合成外，呈源生物还提供配套的NGS表征服务（10M / 50M / 500M reads三档可选，可提供的分析包括本文中的所有分析），以及大规模电转克隆服务即将文库装入质粒骨架，直接用于大肠杆菌或酵母转化。目前有$10^5$和$10^6$ CFU两种规格。

CDR Shuffler™ 探索的是已有CDR序列的排列组合空间，而呈源生物的 Single-point SSV™（定点饱和突变）文库则可以对整条VHH进行全部单点突变扫描。两者配合使用能覆盖更大的序列空间，一起订购享85折优惠。

如何订购

客户只需提供三组CDR序列（CDR1、CDR2、CDR3）和四条框架序列（FWR1–FWR4），可选提供偏好的载体骨架。呈源生物负责全部分子设计、合成、组装和质控工作。

◾ 产品网页：https://rootpath.com/?v=cdr_combi

◾ 联系我们：info@rootpath.com

◾ 预约会议：https://calendly.com/rootpath

关于呈源生物

呈源生物(RootPath)的使命是通过革命性技术突破实现基因合成成本以无限趋近于零。依托自主研发的探路者 DNA 组装技术(PathFinder DNA Assembly™)、分子牙签技术(Molecular Toothpick™)等专利技术平台，呈源生物成功将kb级长度基因片段及克隆基因的合成成本降至行业标准的50%，有效突破合成生物学、基因组/ORF组规模功能筛选、计算蛋白设计等诸多领域的技术瓶颈。呈源生物同时提供多种差异化的基因文库合成及功能筛选服务，尤其在T细胞受体(TCRs)研究领域具有显著优势。We enable biology at scale.